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本生一秒帶您看懂——酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)
酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)是的標(biāo)記免疫分析技術(shù)之一。
它基于一種酶標(biāo)記抗體，能夠檢測固定在96孔或384孔酶標(biāo)板上的抗原，加入的底物可以產(chǎn)生與原始樣品中存在的抗原量相關(guān)的顏色變化或光信號。這是一種簡單而快速的技術(shù)，用于檢測附著在固體表面的抗體或抗原。作為最敏感的免疫分析方法之一，ELISA在實驗室研究、疾病生物標(biāo)志物診斷和各個行業(yè)的質(zhì)量控制方面具有商業(yè)價值。
ELISA的主要類型
根據(jù)抗原固定策略、抗體標(biāo)記策略以及抗體-抗原反應(yīng)類型(直接識別或競爭)的不同，ELISA可以分為：
直接法、間接法、夾心法、競爭法。
直接法ELISA
直接法ELISA是的ELISA形式。抗原通過一段時間的孵化被動地附著在酶標(biāo)板孔底部。在簡單的洗滌步驟后，通過添加與酶共價連接的抗體來檢測抗原。孵化和洗滌后，通過添加色原/底物產(chǎn)生顏色變化。在一段時間后，或在規(guī)定時間通過化學(xué)方法停止酶活性后，在分光光度計中讀取顯色。
由于只涉及一個抗體，所以直接法ELISA適用于樣品中抗原的定性或定量檢測、抗體篩選和表位基因圖譜。這種方法沒有交叉反應(yīng)的二抗，可以在更短的時間內(nèi)進(jìn)行檢測。然而，一抗的免疫反應(yīng)可能會受到酶標(biāo)記的不利影響。標(biāo)記的一抗不常用，因此使用直接法ELISA時，需要為每個特定的ELISA系統(tǒng)標(biāo)記一抗。
間接法ELISA
間接法ELISA檢測是在直接法ELISA的基礎(chǔ)上添加一個標(biāo)記二抗進(jìn)行檢測，是目前的ELISA形式。抗原通過孵化被動地附著在孔上。洗滌后，抗原與抗原特異性抗體一起孵化。洗滌后，添加與酶共價連接的抗體，此抗體對第一次添加的抗體所產(chǎn)生的物種具有特異性，可以檢測所有結(jié)合的抗體。孵化和洗滌后，可以進(jìn)行測試和讀數(shù)。
與直接法ELISA類似，間接法ELISA可用于抗體篩選、表位基因圖譜和蛋白質(zhì)定量檢測。二抗的作用是增強一抗的信號，使間接ELISA比直接ELISA更敏感。然而，它也會產(chǎn)生更高的背景信號，并可能降低整體信號。
夾心法ELISA
夾心法ELISA是最有用的免疫測定形式之一，它設(shè)計用于檢測可溶性抗原。根據(jù)使用的抗體數(shù)量，該ELISA有兩種形式。兩者的原理是相同的，一種是直接將抗原固定在固相上，另一種是將捕獲抗體固定在固相上以捕獲抗原。
? 直接夾心法ELISA(圖3a)中，捕獲抗體被附著在固相上。洗去多余的未結(jié)合抗體后，加入的抗原被特異性捕獲。然后用第二種酶標(biāo)記的抗體直接針對該抗原進(jìn)行檢測。這種類型的檢測適用于有單一物種抗血清可用，且抗原不能很好地附著在板上時。
? 間接夾心法ELISA(圖3b)中，通過第二種未標(biāo)記的抗體來檢測抗原。該抗體則使用酶標(biāo)記的偶聯(lián)物來檢測。重要的是偶聯(lián)物不能與捕獲抗體結(jié)合，因此產(chǎn)生捕獲抗體的物質(zhì)必須是不同的。該方法的優(yōu)點是，可以使用單一的抗偶聯(lián)物來檢測任意數(shù)量樣品中抗體的結(jié)合。
這種方法適用于抗原被其他蛋白質(zhì)污染或低濃度時。在這些情況下，抗原不能以足夠高的濃度直接附著在固相上，以使用直接或間接ELISA進(jìn)行檢測。夾心ELISA依賴于具有至少兩個抗原位點的抗原，以便至少兩個抗體群可以與之結(jié)合。
競爭法ELISA
直接法ELISA是的ELISA形式。抗原通過一段時間的孵化被動地附著在酶標(biāo)板孔底部。在簡單的洗滌步驟后，通過添加與酶共價連接的抗體來檢測抗原。孵化和洗滌后，通過添加色原/底物產(chǎn)生顏色變化。在一段時間后，或在規(guī)定時間通過化學(xué)方法停止酶活性后，在分光光度計中讀取顯色。
上述系統(tǒng)是ELISA的基本配置。所有這些都可以適用于使用競爭或抑制條件測量抗原或抗體，如圖4所述。隨著溶液中游離抗原(抗體)量的增加，將與固定基質(zhì)結(jié)合的抗體(抗原)量會減少。在洗滌步驟之后，添加發(fā)色團(tuán)底物以產(chǎn)生信號(顏色變化或光)。抗體/抗原挑戰(zhàn)引起的信號變化揭示了競爭性抗原/抗體的信息。樣品中的抗原越多，最終孔底結(jié)合的參照抗原的抗體就越少，信號就越弱。
將可能含有抗原的未知樣品與含有已知量純化抗原的類似樣品進(jìn)行比較時，競爭法ELISA適用于測量復(fù)雜混合物中的抗原濃度。
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